TECNOLOGIE PER L'AMBIENTE

Modulo LABORATORIO DI BIOLOGIA VEGETALE

Il modulo fornisce le conoscenze di base sull'organizzazione dei genomi vegetali e sulle tecnologie di sequenziamento. Inoltre fa acquisire le competenze pratiche per:

• ottenere DNA vegetale di qualità adeguata e valutarlo;
• analizzare con strumenti bioinformatici i dati di sequenza, con applicazioni alla caratterizzazione e al monitoraggio della biodiversità vegetale.

Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente conosce:

• la struttura e la composizione dei genomi nucleare, plastidiale e mitocondriale delle piante;
• il valore C e il suo paradosso;
• il DNA ripetuto, gli elementi trasponibili e la poliploidia;
• i principi delle principali piattaforme di sequenziamento (Sanger, short-read, long-read).

Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente sa:

• scegliere e applicare un protocollo di estrazione del DNA adatto al tessuto e alla specie;
• valutare quantità, purezza e integrità del DNA ottenuto;
• usare banche dati e strumenti bioinformatici di base per l'analisi di sequenze, la stima della dimensione del genoma e l'identificazione di specie tramite DNA barcoding.

Autonomia di giudizio. Lo studente sa:

• valutare criticamente la qualità di un campione e di un dato di sequenza;
• riconoscere i limiti e le potenzialità delle diverse tecnologie;
• scegliere l'approccio più adatto a un problema di biologia ambientale.

Abilità comunicative. Lo studente sa descrivere con linguaggio tecnico appropriato le procedure eseguite e i risultati ottenuti, anche con una relazione di laboratorio strutturata.

Capacità di apprendimento. Lo studente acquisisce gli strumenti per aggiornarsi in autonomia su protocolli, piattaforme di sequenziamento e risorse bioinformatiche in rapida evoluzione, consultando letteratura scientifica e documentazione tecnica.

Il modulo prevede 7 ore di lezioni frontali con supporto di slide, discussione di casi di studio e quiz interattivi. Seguono 24 ore di esercitazioni di laboratorio a piccoli gruppi:

• laboratorio di biologia molecolare: estrazione e controllo qualità del DNA;
• laboratorio informatico: analisi bioinformatica.

Conoscenze di base di:

• biologia cellulare e molecolare (struttura del DNA, replicazione, trascrizione);
• genetica (ploidia, meiosi);
• botanica generale.

Lezioni frontali (7 ore)

Organizzazione dei genomi vegetali (3 ore)

• Il DNA: struttura chimica e funzione di trasmissione dell'informazione.
• Il valore C:
  • definizione;
  • stima mediante citometria a flusso e spettro dei k-mer;
  • il paradosso del valore C.
• Composizione del genoma nucleare:
  • geni;
  • DNA ripetuto in tandem (DNA satellite centromerico, telomeri, rDNA, microsatelliti);
  • elementi trasponibili (classi I e II) e loro ruolo nell'espansione e nella dinamica dei genomi.
• Poliploidia, duplicazioni genomiche e pangenoma.
• Genomi degli organuli:
  • struttura quadripartita del plastoma;
  • variabilità del genoma mitocondriale.
• Marcatori plastidiali e DNA barcoding (rbcL, matK).

Tecnologie di sequenziamento (4 ore)

• Dal metodo Sanger al sequenziamento di nuova generazione:
  • sequenziamento per sintesi (Illumina);
  • long-read (PacBio HiFi, Oxford Nanopore).
• Principi, accuratezza, lunghezza delle letture e costi.
• Dal campione al dato:
  • preparazione delle librerie;
  • formati FASTA/FASTQ;
  • copertura.
• Strategie di assemblaggio e annotazione.
• Perché sequenziare le piante è difficile: dimensione del genoma, ripetizioni, poliploidia, eterozigosità.
• Applicazioni ambientali: barcoding, metabarcoding, monitoraggio della biodiversità.

Laboratorio (24 ore)

Estrazione del DNA vegetale (8 ore)

• Norme di sicurezza.
• Campionamento e conservazione dei tessuti (azoto liquido, gel di silice).
• Lisi e problemi specifici dei tessuti vegetali: parete cellulare, polisaccaridi, polifenoli, metaboliti secondari.
• Estrazione con metodo CTAB e con kit a colonna, con confronto tra i metodi.

Controllo qualità del DNA (4 ore)

• Quantificazione spettrofotometrica (rapporti A260/280 e A260/230) e fluorimetrica.
• Elettroforesi su gel di agarosio e valutazione dell'integrità.
• Requisiti di qualità per le diverse piattaforme di sequenziamento, in particolare il DNA ad alto peso molecolare per il long-read.

Bioinformatica (12 ore)

• Banche dati e risorse genomiche vegetali: NCBI, Ensembl Plants, Phytozome, BOLD.
• Formati di sequenza e controllo qualità delle letture.
• Stima della dimensione del genoma da spettro dei k-mer.
• Ricerca di similarità (BLAST) e identificazione di specie mediante DNA barcoding.
• Esplorazione e visualizzazione di un genoma plastidiale annotato.

1. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. – Biochimica e biologia molecolare delle piante, Zanichelli (capitoli su genoma e organizzazione del DNA).
2. Wendel J.F., Jackson S.A., Meyers B.C., Wing R.A. (2016) – Evolution of plant genome architecture. Genome Biology 17: 37.
3. Shendure J. et al. (2017) – DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature 550: 345–353.
4. CBOL Plant Working Group (2009) – A DNA barcode for land plants. PNAS 106: 12794–12797.
5. Doyle J.J., Doyle J.L. (1987) – A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.
6. Slide delle lezioni, protocolli di laboratorio e materiale didattico forniti dal docente su Studium.

La verifica si svolge nell'ambito dell'esame integrato dell'insegnamento "Tecnologie per l'Ambiente" e consiste in un colloquio orale sugli argomenti trattati a lezione e in laboratorio. Allo studente è richiesta una breve esposizione con il supporto della presentazione power point.

La valutazione tiene conto di:

• correttezza e completezza delle conoscenze;
• capacità di collegare teoria e pratica sperimentale;
• proprietà di linguaggio;
• capacità di interpretare criticamente i dati.

La verifica dell'apprendimento potrà essere effettuata anche per via telematica, qualora le condizioni lo dovessero richiedere.

• Che cos'è il valore C? Perché la dimensione del genoma non è correlata alla complessità dell'organismo?
• Quali componenti del DNA ripetuto sono responsabili delle grandi dimensioni di alcuni genomi vegetali?
• Descrivi la struttura del genoma plastidiale e spiega perché i geni plastidiali sono usati come DNA barcode.
• Quali problemi pone l'estrazione del DNA dai tessuti vegetali e come li risolve il metodo CTAB?
• Un campione mostra A260/280 = 1,8 e A260/230 = 1,2: come interpreti questi valori?
• Quali differenze ci sono tra sequenziamento short-read e long-read? Quale sceglieresti per assemblare un genoma ricco di elementi trasponibili, e perché?